药物分析之西药分析——生物检定统计法(一)
生物检定统计法
一、总则
生物检定法是利用药物对生物体或其离体器官组织等所起的药理作用来检定药物效价的方法，用于无适当理化方法进行检定的药物。
生物检定统计法主要叙述应用生物检定时必须注意的基本原则、一般要求、实验设计及统计方法。有关品种用生物检定的具体实验条件和要求，必须按照该品种生物检定法项下的规定。
生物检定标准品 凡中国药典规定用生物检定的品种都有它的生物检定标准品(s)。(s)都有标示效价，以效价单位(u)表示，其含义和相应的国际标准品的效价单位一致。
供试品
供试品（t）或（u）是供检定其效价的样品，它的活性组分应与标准品基本相同。
a<[t]>或a<[u]>是（t）或（u）的标示量或估计效价。
等反应剂量对比
生物检定是将（t）和其（s）在相同的实验条件下同时对生物体或其离体器官组织等的作用进行比较，通过对比，计算出它们的等反应剂量比值(r),以测得（t）的效价p<[t]>。
r是（s）和（t）等反应剂量（ds、dt）的比值，即r＝ds/dt。
m是（s）和（t）的对数等反应剂量（xs、xt）之差，即
m＝logds－logdt＝xs－xt。r＝antilogm。
p<[t]>是通过检定测得（t）的效价含量,称（t）的测得效价；是将效价比值(r)用(t)的标示量或估计效价a<[t] >校正之后而得。即p<[t]>=a<[t]>·r或p<[t]>＝a<[t]> ·antilogm。
检定时，（s）按标示效价计算剂量,（t）按标示量或估计效价(a<[t]>)计算剂量,注意调节（t）的剂量或调整其标示量或估计效价,使(s)和(t)的相应剂量组所致的反应程度相近。
生物变异的控制
生物检定具有一定的实验误差，其主要来源是生物变异性。因此生物检定必须注意控制生物变异，或减少生物变异本身，或用适宜的实验设计来减小生物变异对实验结果的影响，以减小实验误差。控制生物变异必须注意以下几点。
(1) 生物来源、饲养或培养条件必须均一。
(2) 对影响实验误差的条件和因子，在实验设计时应尽可能作为因级限制，将选取的因级随机分配至各组。例如体重、性别、窝别、双碟和给药次序等都是因子，不同体重是体重因子的级，雌性雄性是性别因子的级，不同窝的动物是窝别因子的级，不同双碟是碟间因子的级，给药先后是次序因子的级等。按程度划分的级（如动物体重），在选级时，应选动物较多的邻近几级，不要间隔跳越选级。
(3) 按实验设计类型的要求将限制的因级分组时，也必须严格遵守随机的原则。
误差项
指从实验结果的总变异中分去不同剂量及不同因级对变异的影响后，剩余的变异成分，用方差(s<2>)表示。对于因实验设计类型的限制无法分离的变异成分，或估计某种因级对变异的影响小，可不予分离者，都并入s<2>。但剂间变异必须分离。
误差项的大小影响标准误s<[m]>和可信限（fl）。
不同的检定方法和实验设计类型，分别按有关的公式计算s<[2]>。
可靠性测验
平行线检定要求在实验所用的剂量范围内，对数剂量的反应（或反应的函数）呈直线关系，供试品和标准品的直线应平行。可靠性测验即验证供试品和标准品的对数剂量反应关系是否显著偏离平行偏离直线，对不是显著偏离平行偏离直线（在一定的概率水平下）的实验结果，认为可靠性成立，方可按有关公式计算供试品的效价和可信限。
可信限可信限（fl）标志检定结果的精密度。m的可信限是m的标准误s<[m]>和t值的乘积（t·s<[m]>），用95％的概率水平。m＋t·s<[m]>是可信限的高限；m－t·s<[m]>是可信限的低限。用其反对数计算得r和p<[t]> 的可信限低限及高限，是在95％的概率水平下从样品的检定结果估计其真实结果的所在范围。
r或p<[t]>的可信限率（fl％）是用r或p<[t]>的可信限计算而得。
计算可信限的t值是根据s<2>的自由度（f）查t值表而得。
t值与f的关系见表一。
表一 t值表（p＝0.95） ────┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬──── f │ t │ f │ t │ f │ t │ f │ t ────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼──── 3 │ 3.18 │ 8 │ 2.31 │ 14 │ 2.15 │ 30 │ 2.04 4 │ 2.78 │ 9 │ 2.26 │ 16 │ 2.12 │ 40 │ 2.02 5 │ 2.57 │ 10 │ 2.23 │ 18 │ 2.10 │ 60 │ 2.00 6 │ 2.45 │ 11 │ 2.20 │ 20 │ 2.09 │ 120 │ 1.98 7 │ 2.37 │ 12 │ 2.18 │ 25 │ 2.06 │ ∞ │ 1.96 ────┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴────
各品种的检定方法项下都有其可信限率的规定,如果检定结果不符合规定,可缩小动物体重范围或年龄范围，或调整对供试品的估计效价或调节剂量，重复实验以减小可信限率。
对同批供试品重复试验所得n次实验结果(包括fl％超过规定的结果)，可按实验结果的合并计算法算得p<[t]>的均值及其fl％作为检定结果。
二、直接测定法
直接测得药物对各个动物最小效量或最小致死量的检定方法。如洋地黄及其制剂的效价测定。
xs和xt为s和t组各只动物的对数最小致死量， 它们的均值ys和yt为s和t的等反应剂量，n<[s]>和nt为s和t组的动物数。
（注）：由于计算机内无均值符号，故用ys和yt代替。
1.效价计算
按(1)～(3)式计算m、r和p<[t]>。
m＝ys －yt
(1)
r＝antilog（ys-yt）＝antilog m
(2)
p<[t]>＝a<[t]>·r
(3)
2.误差项及可信限计算
按(4)～(8)式计算s<2>、s<[m]>及r或p<[t]>的fl和fl％。
∑(xs)<2> （∑xt）<2> ∑(xs)<2>－ ───── ＋∑(xt)<2>－ ───── ns nt s<2> ＝────────────────────────── (4) ns＋nt－2
f＝ns＋nt－2
用此自由度查表一得t值
┌───────────── │ ns＋nt s<[m]>＝ │ s<2> ·────── √ ns·nt
r的fl＝antilog(m±t·s<[m]>)
执业药师2017药物分析学考点：生物碱类药物的分析
第十四章 生物碱类药物的分析
掌握盐酸麻黄碱、硫酸阿托品、硫酸奎宁、盐酸吗啡和硝酸士的宁的鉴别、杂质检查和含量测定方法。
第一节 盐酸麻黄碱的分析
一、鉴别
1.双缩脲反应 氨基醇特征反应
与硫酸铜和氢氧化钠试液反应生成紫色配位化合物，加入乙醚后醚层呈紫红色，水层呈蓝色。
2.红外光谱
3.Cl-反应
二、含量测定：非水滴定法。本品为盐酸盐，需预先加入醋酸汞。
第二节 硫酸阿托品的分析
一、鉴别
1.Vitali反应 托烷生物碱特征反应：与发烟硝酸共热，冷后加醇制氢氧化钾，显深紫色。
2.红外光谱
3.硫酸盐鉴别反应
(1)加氯化钡生成白色沉淀，沉淀在盐酸或硝酸中不溶解
(2)加醋酸铅生成白色沉淀，沉淀在醋酸铵或氢氧化钠试液中溶解
(3)加盐酸不生成白色沉淀，与硫代硫酸盐区别
二、特殊杂质检查
1.莨菪碱检查：阿托品为外消旋体，消旋不完全时引入的莨菪碱具有旋光性。测定供试品溶液旋光度来控制莨菪碱限量。
2.其他生物碱检查：制备过程中引入的莨菪碱、颠茄碱等杂质碱性弱于阿托品。取供试品盐酸水溶液，加入氨试液，其他生物碱立即游离发生浑浊。规定加氨试液不得立即发生浑浊。
三、含量测定
1.原料药 非水滴定法
1mol硫酸阿托品消耗1mol的高氯酸
2.片剂、注射剂 酸性染料比色法
在一定pH值条件下，生物碱盐的阳离子和酸性染料的阴离子定量结合生成配位化合物，即离子对，此离子对易溶于有机溶剂，经有机溶剂(氯仿等)提取后，比色测定含量。
(BH+)W +(In-)W → (BH+?In-)W →(BH+?Iln-)O
对照品比较法测定含量。
第三节 硫酸奎宁的分析
一、鉴别
1.荧光反应 加水溶解后，加稀硫酸成酸性，显蓝色荧光
2.绿奎宁反应 含氧喹啉衍生物特征反应
在药物微酸性水溶液中滴加微过量溴水，再加入过量氨试液，显翠绿色。
3.硫酸盐鉴别
4.红外光谱
二、特殊杂质检查
1.氯仿-乙醇中不溶物检查
检查制备过程中引入的无机盐与其他生物碱。取供试品2g，不溶物滤过干燥至恒重，遗留残渣不得过2mg。
2.其他金鸡纳碱的检查：薄层色谱高低浓度对比法
三、含量测定
1.原料药 非水滴定法 1mol硫酸奎宁消耗3mol的高氯酸
2.片剂 提取中和法 将适量样品置于碱性溶液中，使奎宁游离，用氯仿提取后再用非水滴定法滴定。1mol硫酸奎宁消耗4mol的高氯酸。
药物分析：常用定量分析法与应用——生物检定法
（一）概述
生物检定法是利用药物对生物体（整体动物、离体组织、微生物等）的作用以测定其效价或生物活性的一种方法。它以药物的药理作用为基础、生物统计为工具，运用特定的实验设计，通过供试品和相应的标准品或对照品在一定条件下比较产生特定生物反应的剂量比例，来测得供试品的效价。
（二）生物检定法的应用范围
1.药物的效价测定对一些采用理化方法不能测定含量或理化测定不能反映临床生物活性的药物可用生物检定法来控制药物质量。中国药典收载了洋地黄、胰岛素、肝素、绒促性素、缩宫素、硫酸鱼精蛋白等的生物测定法及各种抗生素的微生物测定法。
有些天然药物、生物制品（包括生化药物）往往因结构复杂，而且往往又是由结构类似、比例不定的多种成份组成，很难用理化方法反映其生物活性；另一些药物，尤其是一些激素类药物，其结构相近，而生物活性不同；还有些药物虽可用理化方法测定含量，但含量不能完全反映效价，如天青a变色反应测定肝素，测定结果与抗凝血效价不一致。因此，这些药物的质量控制都离不开生物检定。
2.微量生理活性物质的测定一些神经介质，激素等微量生理活性物质，由于其很强的生理活性，在体内的浓度很低，加上体液中各种物质的干扰，很难用理化方法测定。而不少活性物质的生物测定法由于灵敏度高、专一性强，对供试品稍作处理即可直接测定。如乙酰胆碱，5-羟色胺等活性物质的测定。
3.中药质量的控制中药成份复杂，大部分中药的有效成份尚未搞清，难以用理化方法加以控制，但可用一些以其疗效为基础的生物测定方法来控制其质量。
4.某些有害杂质的限度检查如农药残留量、内毒素等致热物质、抗生素及生化制剂中降压物质的限度检查等。
由于生物差异的存在，生物检定结果误差较大，重现性较差，需要控制的条件较多，加上测定费时，计算繁琐，所以，生物检定主要用于无适当理化方法进行检定的药物，补充了理化检验的不足。
